Úvodem

Oblast regenerativní medicíny zažila v posledních letech pozoruhodné pokroky nabízející inovativní řešení pro obnovu poškozených tkání a orgánů. Jedním z takových výzkumných směrů je neovaskularizace zubní dřeně pomocí buněčných nosičů („scaffold“) a kmenových buněk. Během své stáže na UTHSC, po dobu čtyř měsíců, jsem měla jedinečnou příležitost ponořit se do této oblasti bádání a přispět k probíhajícím snahám o revoluci v regeneraci zubní dřeně.

UTHSC se nachází v Memphisu ve státě Tennessee a zajišťuje vzdělávání, výzkum i klinickou péči. Jednou ze šesti fakult UTHSC je i fakulta zubního lékařství, která byla založena v roce 1878 a je třetí nejstarší veřejnou vysokou školou zubního lékařství v USA.

Nabídka této stáže přišla po prezentaci výsledků výzkumu o kmenových buňkách zubní dřeně, probíhajícího na Stomatologické klinice LF UK a FN v Hradci Králové, na mezinárodní konferenci Root Summit, která se konala v květnu 2022 v Praze. Prezentované výsledky zaujaly profesora Davida E. Jaramilla, který působí jako endodontista na University of Texas Health Science Center v Houstonu (USA) a který mne spojil s profesorem Georgem T.-J. Huangem.

Profesor George T.-J. Huang je v současné době vedoucím oddělení pro výzkum kmenových buněk a regenerační terapie na UTHSC. Je bývalým profesorem v oboru endodoncie na Boston University a Columbia University. Publikoval již přes 180 výzkumných prací, včetně článků o buněčné terapii, tkáňovém inženýrství, regenerativní medicíně a imunoterapii ve vysoko impaktovaných časopisech.

Význam stáže

Zubní dřeň je náchylná k poškození různými faktory, jako jsou trauma nebo zubní kaz. Principem tradičních metod léčby je odstranění poškozené tkáně, což zub vystavuje riziku oslabení a možné ztráty v průběhu času. Oproti tomu regenerativní endodoncie zahrnuje kombinaci strategií k podpoře regenerace tkáně zubní dřeně. Koncept neovaskularizace nabízí alternativní přístup tím, že se snaží obnovit krevní zásobu do zubní dřeně, usnadňuje tak její regeneraci a zvyšuje životnost zubu. V současné době probíhají výzkumy in vitro i in vivo na zvířatech se snahou objasnit tento princip, který by měl zásadní klinický význam.

Buněčné nosiče („scaffold“) se staly slibnými nástroji v tkáňovém inženýrství díky své biokompatibilitě a schopnosti napodobit mezibuněčnou hmotu. Společně s kmenovými buňkami mohou podporovat neovaskularizaci a růst funkční tkáně zubní dřeně, čímž mohou změnit postupy zubní péče. Tyto buněčné nosiče lze vyrobit z různých materiálů, včetně přírodních polymerů (jako je kolagen a fibrin) nebo syntetických polymerů, z nichž každý je vybírán na základě schopnosti podporovat přilnavost, proliferaci a diferenciaci buněk.

Cíl stáže

Během čtyřměsíční stáže bylo mým hlavním cílem získat zkušenosti v oblasti regenerace zubní dřeně při využití kmenových buněk zubní dřeně a navázat spolupráci na mezinárodní vědecké úrovni. Vzhledem k omezené době mého pobytu jsme se s profesorem Georgem T.-J. Huangem dohodli, že se připojím k již probíhajícím výzkumným projektům.

Průběh stáže

V prvních týdnech stáže jsem podstoupila mnoho školení o bezpečnosti práce a kurzů dovolujících mi pracovat s laboratorními zvířaty, zejména hlodavci, ale i s prasaty. Po absolvování jsem se naplno zapojila do projektů probíhajících v laboratoři.

Během stáže jsem si rozšířila dovednosti v oblasti kultivace, pasážování a kryokonzervace kmenových buněk izolovaných ze zubní dřeně stálých zubů, mikrovaskulárních endoteliálních buněk a kmenových buněk zubní dřeně diferencovaných v endoteliální buňky. Právě mikrovaskulární endoteliální buňky pro mě byly zcela novým typem buněk, se kterým jsem měla možnost pracovat. Zapojila jsem se do in vitro i do in vivo projektů. Seznámila jsem se s technickým vybavením laboratoře, naučila se mnoho nových laboratorních postupů zahrnujících například značení buněk fluorescenčními proteiny pro jejich vizualizaci přes tvrdé zubní tkáně, analýzy zahrnující polymerázové řetězové reakce, práci s konfokálním mikroskopem a spektrometrem. Rozšířila jsem si zkušenosti s využitím kolagenních a fibrinových buněčných nosičů v regeneraci zubní dřeně. Výzkumným cílem bylo zodpovědět, který z přírodních polymerů lépe podporuje přilnavost, růst a diferenciaci kmenových buněk, a tím lépe podporuje proces neovaskularizace.

Sama jsem se stala hlavním řešitelem několika in vivo výzkumných záměrů. Implantovala jsem fragmenty kořenů zubů s kmenovými buňkami ve fibrinových nebo kolagenních buněčných nosičích pod kůži myší a po následném histologickém zpracování sledovala úspěšnost prorůstání novotvořených cév do nitra fragmentů zubů. Pro kontinuální sledování novotvorby cév jsem implantovala fragmenty kořenů zubů s kmenovými buňkami v buněčných nosičích do zařízení, které jsem následně implantovala do svrchní vrstvy kůže myší a přes mikroskopické sklíčko v pravidelných intervalech pod konfokálním mikroskopem sledovala prorůstání cév z cévního zdroje, cévy kůže myši, ke kmenovým buňkám uloženým v nosičích uvnitř fragmentů kořenů zubů. Pro potenciální klinickou aplikaci je nutné studovat mnoho proměnných, jako je počet nasazených kmenových buněk do nosiče, fyzikální vlastnosti samotného nosiče, kdy důležitá je zejména hustota vytvořeného mezibuněčného prostoru, aby byl na jednu stranu podpůrný, ale na druhou stranu, aby umožňoval růst cév a přísun živin ke kmenovým buňkám.

Studovala jsem také na in vitro i in vivo modelech biokompatibilitu buněčných nosičů a analyzovala vliv výplňových a tmelicích materiálů na přežití, proliferaci a diferenciaci kmenových buněk zubní dřeně.

Získané výsledky všech projektů byly velmi slibné a daly podnět k dalším výzkumům zaměřeným na optimalizaci složení buněčných nosičů, zdokonalení protokolů pro neovaskularizaci zubní dřeně a diferenciaci kmenových buněk a ke zkoumání dlouhodobé životaschopnosti a funkčnosti získané regenerované tkáně.

Velice si vážím vedení profesora George T.-J. Huanga po celou dobu mého pobytu. Práce byla organizovaná, ale i diskutovaná v pravidelných týdenních setkáních, při nichž se hodnotily dosavadní výsledky a plánovaly další cíle.

Stáž byla přínosná nejen z praktického hlediska práce v laboratoři. Každý týden na UTHSC probíhaly pravidelně cykly vědeckých seminářů. Jejich společným tématem byla vždy regenerativní medicína.

Zaujala mne přednáška Dr. Huojuna Caoa z Iowa Institute for Oral Health Research, University of Iowa, s tématem transkripční regulace a iniciace vývoje zubního zárodku. Dr. Huojun Cao se snažil označit transkripční faktory zodpovědné za založení zubu, aby bylo následně možné iniciovat vytvoření nového zubního zárodku v místech, kde byl zub ztracen či nebyl vůbec založen. Jeho vědecký tým byl schopen izolovat dentální laminu z myších embryí a zkoumat ji na molekulární úrovni. Bohužel i přes odebrání dentální laminy z různých částí byla výsledkem jejich snažení vždy iniciace řezáku. Je patrné, že výzkum v této oblasti je stále na úplném počátku, a i s rozvojem zdrojů a techniky mají zubní tkáně velmi komplexní a těžko reprodukovatelnou stavbu.

Přednášek na téma regenerativní medicíny bylo za mého pobytu velké množství a nejednalo se pouze o zubní problematiku. Velká část z nich byla věnována výzkumu v oblasti regenerace muskuloskeletálního systému, kdy hlavními přednášejícími byli výzkumníci z OHSU Center for Regenerative Medicine v Oregonu.

Navštívila jsem i fakultu zubního lékařství, která měla během mé stáže den otevřených dveří po ukončené rekonstrukci. Navíc, díky tomu, že je profesor George T.-J. Huang jedním z mentorů specializačního programu endodoncie na UTHSC, přizval mě k několika teoretickým lekcím.

Život mimo UTHSC

Můj čtyřměsíční pobyt v Memphisu byl příjemný nejen po pracovních stránkách. Osobně si velice vážím toho, jakým způsobem se ke mně všichni moji mentoři a kolegové po celou dobu mé stáže chovali a s jakou ochotou a přívětivostí mě mezi sebe přijali. Strávili jsme spolu nespočet hodin v laboratoři, ale i mimo ni. Měla jsem možnost poznat nejen tamní jižanskou pohostinnost, ale i jiné kultury ze všech koutů světa. Kolegové z univerzity se stali více přáteli než spolupracovníky, a tak nebylo výjimkou pozvání na společný víkendový piknik, basketbalový zápas a další společné aktivity.

Poznat jih USA byl pro mne také nový zážitek. Město Memphis je považováno za kolébku hudebních stylů „blues“ a „rock and roll“. Navždy bude také spojeno se jménem Elvise Presleyho. Mezi další známé hudební velikány, kteří zde vyrůstali či žili, patří Johnny Cash, Jerry Lee Lewis, Carl Perkins, Robert Johnson, B. B. King, Isaac Hayes, Booker T. Jones, Al Green a řada dalších.

Závěr

Tato stáž se pro mě stala unikátní a obohacující zkušeností. Výsledky výzkumu neovaskularizace mají dalekosáhlý význam. Do budoucna nabízí regenerativní endodoncie potenciálně jiný způsob léčby a v současné době inspiruje další výzkumy v oblasti tkáňového inženýrství a regenerativní medicíny. Jsem velmi vděčná za získané zkušenosti v této klíčové oblasti výzkumu. Věřím, že získané poznatky obohatí náš vědecký tým na Stomatologické klinice LF HK a FN v Hradci Králové a velice si cením navázaní zcela nového kontaktu s UTHSC.

Fotogalerie